سنجش پروتئین ها (بخش اول بیوره ، لوری)
تعیین کمی پروتئین ها
· به طور کلی یک متد رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد .
· انتخاب یک متد ، وابسته به نوع و ماهیت پروتئین ، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی ، سرعت مورد لزوم ، دقت و حساسیت تست است .
متدهای مورد استفاده برای تعیین پروتئینها
· Biuret Test بیوره
· لوری Folin-Ciocalteu ( Lowry ) Assay
· بیسین چونینیک Bicinchoninic Acid ( BCA ) Assay
· برادفورد Dye-Binding ( Bradford ) Assay
· اولترا ویولت Ultraviolet Absorbance
تست بیوره (Biuret)
• Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.
• Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.
• Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.
• Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.
• Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.
ویژگیهای تست بیوره (Biuret)
· تکرار پذیر
· عوامل تداخل کننده بسیار زیاد (به عنوان مثال نمک آمونیوم )
· انحراف کم نسبت به متدهای لوری یا اولترا ویولت
· احتیاج به مقدار زیاد پروتئین (1-20mg)
· حساسیت کم
تست بیوره (Biuret)
1- 15 دقیقه قبل از استفاده ، اسپکتوفوتومتر را روشن شود.
2- نمونه ها با بافر رقیق شود . به صورت تقریبی 1-10mg/ml . به هر لوله تست 1ml نمونه اضافه شود . روش دوبلیکیت مورد لزوم است.
3- یک لوله حاوی 1ml بافر برای مرجع یا بلنک تهیه شود .
4- BSA با غلظت 10mg/ml تهیه کرده و استاندارهای 1 تا 10mg/ml از آن ساخته شود .
5- به هر لوله 9ml واکنشگر بیوره ریخته ، بلافاصله ورتکس شده ، اجازه دهید 20 دقیقه بماند .
6- در طول موج 550nm خوانده شود .
تست لوری (Lowry)
• Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951.
• Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978.
• Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
• Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).
ویژگیهای تست لوری (Lowry)
· حساسیت در سرتاسر رنج آن
· قابل استفاده در دمای اتاق
· قابل استفاده در مقیاس میکرو پلیت
· 10-20 مرتبه حساستر از UV detection
· بسیاری از مواد در تست تداخل ایجاد می کنند . (اسیدهای قوی ، آمونیوم سولفات)
· زمان قابل توجهی را می طلبد
· این تست نسبت به نور حساس است ، لذا در طول انجام آن باید از نور دور باشد .
· میزان رنگ با پروتئین های مختلف ، تغییر می کند
تست لوری (Lowry)
1- نمونه ها که شامل 100 µg پروتئین است اضافه شود .
2- همه لوله ها با آب به حجم 1ml رسانده شود .
3- محلول تست آماده و معرف فولین رقیق شود .
4- در هر لوله 5ml معرف تست ریخته و کاملا ورتکس شود .
5- لوله ها به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبیت شود .
6- به هر لوله 0.5ml محلول رقیق شده فولین اضافه شود .
7- در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبیت شود .
8- لوله ها ورتکس شده .اسپکتوفوتومتر با بلنک صفر شده ، جذب آن را در 500-750nm خوانده شود .
Xin Li
Scott Group
05/10/2005
نظرات شما عزیزان:
|
روز بخير كاربر مهمان! 
